IVT（In Vitro Transcription）是mRNA生产过程中最关键的步骤。一个优秀的IVT体系不仅可以提高产品产量，减少原料消耗，降低生产成本，还能够确保mRNA分子的完整性、加帽率，以及dsRNA杂质的掺入等核心质量指标。此外，它还可以降低下游纯化工艺的难度，贯穿整个生产流程。IVT反应总体上是相对简单的，标准的IVT体系主要包括DNA模板、T7 RNA聚合酶（T7RNAP）、NTPs、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂和反应缓冲液等。DNA模板作为mRNA转录的基础，多为PCR产物或线性化质粒，并包含T7启动子、5'UTR、CDS、3'UTR和Poly(A)等元件；NTP作为mRNA的转录底物，可以通过替换成修饰核苷酸以提升mRNA的稳定性和免疫原性；无机焦磷酸酶和RNase抑制剂则在反应中发挥辅助作用，前者可以水解转录过程中所产生的焦磷酸，提升反应效率，后者则抑制可能的RNase污染。

T7RNAP是整个反应体系的核心酶，负责识别DNA模板并将其转录为mRNA。除了之前提到的质粒模板质量外，影响IVT效果的主要成分是T7RNAP和缓冲液体系。T7RNA聚合酶在IVT体系中识别T7启动子序列，并结合DNA模板催化RNA的合成。与其他RNA聚合酶相比，T7RNAP在识别T7启动子序列时具有高度特异性，且不需要额外的蛋白质或辅助因子的干预，可有效完成转录。T7RNAP在结构上类似于一个右手，包括N端结构域（1-312氨基酸）和C端结构域（313-883氨基酸），C端结构域又细分为拇指、手掌和手指亚结构域，DNA模板结合在其间的空隙内。

最近，研究小组通过DOE方法探索IVT反应中各个参数如何影响mRNA与saRNA的产量和质量（完整转录本比例），发现温度对长片段saRNA的完整度具有显著影响。随着温度从20℃上升到42℃，虽然saRNA产量有所增加，但在温度超过32℃时，saRNA的完整度迅速下降。针对优化saRNA的完整度，定向筛选低温转录的T7RNA聚合酶可能成为新的研究方向。Wu等人则报道T7RNAP的热稳定突变体在高温条件下进行转录时，可以减少3'端过度延伸导致的dsRNA。

尊龙凯时-人生就是博的团队利用基于荧光信号的激活液滴分选技术（FADS）结合酶定向进化平台，筛选出了多种T7RNA聚合酶的突变体，包括耐热型、高比活型和低dsRNA型。FADS技术是当前主流的微流控筛选技术，通过设计不同的荧光探针或酶级联反应实现目标酶基因型与荧光的耦合，其处理微液滴分选的通量高达5000个/s，同时可以实现分选的可视化。

尊龙凯时-人生就是博团队的研究表明，耐高温的T7RNAP在50℃下可以更高效地合成circRNA。在对T7RNAP转录产物的3'端一致性进行改造时，G47A + 884G的突变体表现出显著降低dsRNA的效果，但该酶的酶活性偏低，限制了其在工业端的应用。我们继续关注如何在增强T7RNAP转录产物3'端一致性的同时，提高酶的活性。

缓冲液对IVT体系的影响同样关键。拥有高性能的酶固然重要，但需通过合理的反应缓冲液来最大化其性能。IVT缓冲液通常包括多种成分，如盐类、pH缓冲剂和二价阳离子等，这些成分的浓度和比例直接影响RNA聚合酶的活性、特异性和稳定性，以及RNA的质量和功能。Rosa等通过贝叶斯优化方法对12个不同参数进行了实验，显著提升了mRNA的产量。

在选择pH和镁离子浓度方面，研究表明，大多数RNA聚合酶在接近中性或略偏碱性环境中活性最佳，而RNA在中性或偏酸性环境中更稳定。镁离子参与T7RNAP与DNA模板的结合，一个合适的镁浓度可以提升聚合酶的活性。在多项研究中推荐的合适镁离子浓度为40-60 mM，且高达75 mM能获得最高的RNA产量。

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